华东理工大学钱江潮Angew：结构指导的TdT重新设计实现规模化酶法合成DNA用于数据存储。论文信息
研究背景
随着全球数据量的指数级增长，传统存储介质面临存储密度、长期稳定性和能耗等方面日益严峻的挑战。DNA以其超高信息密度和稳定性，成为下一代数据存储的理想介质。然而，DNA数据存储的实用化受限于写入步骤——即数字信息到DNA序列的合成过程。酶法合成DNA是规模化DNA制造的绿色替代方案，其中的核心酶，末端脱氧核苷酸转移酶TdT，作为信息打印机，可催化脱氧核苷酸聚合结合到 DNA 分子的 3'-OH末端，无需模板从头合成DNA。然而，野生型TdT对3'-ONH2可逆终止子的催化效率低，且易聚集失活，酶活低成本高的问题严重制约酶法合成DNA的经济可行性。已有研究多聚焦于改造活性中心提高酶活或融合标签促进可溶表达等单一维度的策略，未能从根源上解决聚集倾向与催化效率的内在耦合。结构指导的酶工程和AI辅助设计为TdT综合性能提升提供了新契机，有望协同优化其可溶性表达与催化效率，建立面向数据存储的规模化高效酶催化DNA合成方法，具有重要的科学意义和应用价值。
文章概述
近日，由钱江潮教授带领华东理工大学与上海交通大学科研团队，提出了一种AI辅助蛋白结构指导的酶工程策略，可显著提升TdT的可溶性表达与催化效率。该技术基于结构指导的理性设计思想，利用AlphaFold预测TdT三维结构进行蛋白聚集倾向分析，通过改造表面疏水区域以增强可溶性表达。在此基础上，通过结构预测、分子对接和定点突变优化活性中心，提高对可逆终止子的催化效率。利用该策略得到的突变体HL2-LKI无需融合标签和低温诱导，即可实现3.4 g L-1的可溶性蛋白表达，对四种可逆终止子的平均掺入效率达99.9%，酶生产成本降至约0.7美元/克，为野生型的44.6%。作者进一步以磁珠为固相载体，通过8轮两步酶法合成，将文本hi SJTU！编码为96 bits信息，NGS测得平均写入准确率达98.9%。经估算，将来若结合百万级高通量合成平台，DNA写入成本仍具有进一步下降空间。该研究成果对于推动酶法DNA合成的规模化应用具有指导和借鉴意义。
图文导读
图1 结构指导重设计高表达高活性分子催化剂TdT用于DNA数据存储a. DNA数据存储流程示意图。写入步骤是制约该技术实际应用的主要瓶颈，利用酶法合成DNA时，TdT催化可逆终止子活性低、易聚集，同时提升TdT可溶表达水平与催化效率，是建立规模化的酶法DNA写入体系的关键。b. 结构指导的TdT优化与功能验证框架。基于结构模型识别表面易聚集区域，通过定向替换疏水残基，在保持催化骨架的同时增强可溶性表达；利用分子对接和定点突变，提高对3'-ONH2-dNTPs的催化效率。
图2 替换易聚集区疏水残基克服TdT的聚集限制a. 结构指导设计高可溶性TdT突变体。基于AlphaFold2预测分析野生型ZaTdT-B结构的聚集倾向区域（红色），图中所示远离活性中心的线性区域（131–149位残基）和loop2区域（410–428位残基）。右侧为重新设计的突变体HL1、HL2和HL3结构及聚集分析结果。b. ZaTdT-B（WT）与HL2在16、23、30和37°C诱导后的可溶性表达比例对比。c. 半定量分析摇瓶中不同温度和时间诱导后的可溶性蛋白产量。d. 5 L生物反应器中不同温度诱导后的细胞生长及可溶性TdT产量曲线。e. 基于5 L生物反应器工艺的酶生产成本比较，成本估算涵盖发酵与纯化所需材料，以及搅拌和冷却等能耗。
图3 结构指导的活性位点改造提高对3'-ONH2-dNTPs的催化活性a. HL2和HL2-LKI与3'-ONH2-dATP复合物的分子对接模型。放大的底物结合隧道入口区域，红色箭头所示为3'-ONH2-dATP与残基R335、K337和N339之间的氢键相互作用。b.变性PAGE分析HL2及其衍生突变体催化3'-ONH2-dNTPs的反应产物（酶浓度为1 mg mL-1）。引物DNA（iDNA）的5端标记FAM。c. 对（b）中条带强度的定量分析，展示四种3'-ONH2-dNTPs的掺入效率，结果为三次独立重复实验的平均值。d. 四种3'-ONH2-dNTPs的平均催化效率。e. 5 L生物反应器中不同温度诱导后的细胞生长及可溶性TdT产量曲线。f. 基于5 L生物反应器过程的HL2-LKI与野生型ZaTdT-B生产成本及时间对比。
图4 利用TdT突变体HL2-LKI实现DNA数据的高效准确写入a. 基于HL2-LKI的酶法DNA写入流程示意图，包含8轮迭代的两步合成循环。b. 酶法合成过程中DNA延伸产物的变性PAGE分析。c. 每一轮合成循环所得DNA产物的NGS分析。d. DNA写入过程中各类错误占比分布。 e. 基于5 L生物反应器过程的LKI（HL2-LKI）与WT（ZaTdT-B）的酶生产成本对比。f. 基于HL2-LKI的喷墨打印法与已报道酶法合成DNA的写入成本估算对比。
结论
团队提出了一种结构指导的酶工程改造策略，用于协同提升TdT的可溶性表达与催化效率。该研究基于AI预测蛋白结构，针对蛋白表面聚集倾向区域进行疏水残基定向替换增强可溶性表达，并利用分子对接与定点突变优化活性中心以提高对可逆终止子的催化效率。所得到的突变体HL2-LKI在5 L生物反应器中无需低温诱导即可在诱导8小时达到3.4 g L-1的可溶性蛋白产量，酶生产成本降至约0.7美元/克，对四种可逆终止子的平均掺入效率达99.9%。作者以磁珠为固相载体，利用HL2-LKI，通过8轮两步酶法合成将文本hi SJTU！编码为96 bits信息，平均写入准确率达98.9%。该研究有利于推动酶法DNA合成的规模化应用，也对类似酶的改造和重设计具有指导和借鉴意义。
期刊介绍
Angewandte Chemie是全球化学领域最具影响力的顶级期刊之一，由Wiley出版，创刊于1887年，最新影响因子为16.9。
来源：Angewandte Chemie
